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qRT-PCR相对定量分析,你学会了吗

频道:行业资讯 日期: 浏览:376

通常,在科学实验中,我们会对所研究的目的基因进行表达分析,常用的方法有实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)。有些做RNA-seq的小伙伴,在做完转录组分析之后,一般也都会要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本表达是否可靠。这里我们讲一下常用的Livak法(2^-[gf]2206[/gf][gf]2206[/gf]Ct法)是如何计算的,以及在qRT-PCR中常见问题和解决方案。

qRT-PCR的原理:

以基因的cDNA为模板进行PCR扩增,在PCR扩增过程中,荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比。通过实时检测PCR扩增过程中荧光信号的变化,可以获得关于相对定量基因表达水平的信息。qRT-PCR一般包括SYBR染料法和Taqman探针法。例如,SYBR染料游离时发出的荧光信号微乎其微,但当其与双链DNA的小沟结合后,荧光信号强度会大大增加,表明双链DNA总量也发生了很大变化。在qRT-PCR实验中,Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到预设阈值的周期数(cycle)。

扩增曲线及溶解曲线如下图所示:

扩增曲线主要用于评估扩增引物的效率。当使用引物特异性较好时,扩增曲线呈现出单一峰值,这样的实验结果更加可靠。

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一、Livak法的详细步骤:

在这里,我们有一个对照组(wt),一个处理组(mut),还有一个内参基因(ATCB)和目的基因(OCA2),希望比较处理组与对照组中目标基因的相对表达差异,也就是计算2^-[gf]2206[/gf][gf]2206[/gf]Ct,数据如下图所示:

1.计算每个组内参基因(ATCB)Ct值的均值

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2.计算每组中待检目的基因的Ct值与内参基因的Ct值之差(即[gf]2206[/gf]Ct)

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3.计算对照wt组中[gf]2206[/gf]Ct值的均值,然后将处理mu组中每个样本的[gf]2206[/gf]Ct值减去对照wt组的[gf]2206[/gf]Ct 均值,以得到[gf]2206[/gf][gf]2206[/gf]Ct值

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4.进行相对表达量计算,即将处理mu组相对于对照wt组的[gf]2206[/gf][gf]2206[/gf]Ct值作为指数,并计算2的负幂次方(2^-[gf]2206[/gf][gf]2206[/gf]Ct)

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二、常见问题和解决方案:

1、扩增曲线中Ct值出现过晚

cDNA模板降解或cDNA模板浓度低:Ct值越晚,表示内参基因和目的基因序列起始浓度越低。可以重新制备cDNA模板重复实验,以及减少cDNA模板稀释倍数重复实验。

扩增效率低:引物或探针的设计可能特异性不强,导致扩增效率低。确保引物或探针的设计准确,避免与非目标序列的非特异性结合。可以重新设计引物或者优化PCR反应条件,比如在qRT-PCR中使用三步法扩增程序。

PCR体系中存在抑制物:样品中可能存在PCR反应抑制物,如残余酚类物质、碳水化合物、盐(胍盐)等。这些抑制物可能会降低PCR效率,导致Ct值偏高。一般来说,纯度好的RNA,A260/ A280比值应大于2.0,如果比值低于2.0,则表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。确保在样品制备过程中使用纯净的试剂和采用可以提取高质量RNA的方法,以去除或稀释潜在的抑制物。

2、在qRT-PCR实验中,内参基因的Ct值正常,而目的基因的Ct值出现较晚

目的基因的表达水平较低:如果目的基因的表达水平较低,PCR扩增需要更长的时间才能达到设定的荧光阈值,因此Ct值会出现较晚。在这种情况下,为了准确测量目的基因的表达水平,内参基因的模板和目的基因的模板应该分开进行稀释(内参基因和目的基因都有其特定的浓度范围,过低或过高的浓度都可能导致结果的不准确性)。也可以使用数字PCR仪检测。

PCR扩增得率低:引物和目的基因序列之间的特异性匹配可能存在问题,导致扩增效率低。可以设计多对引物,从中选择最优的。

3、熔解曲线呈现非单一峰

非特异性扩增:当PCR反应条件不够好或引物与非目的基因序列匹配时,可能会导致非特异性扩增产物的形成。这种情况下,熔解曲线可能显示出多个峰。可通过优化PCR反应条件(进行温度梯度PCR实验,尝试不同温度和延伸时间)、根据引物设计原则来设计新的引物等方法以增加特异性。

引物二聚体:引物对之间的非特异性结合,导致在熔解曲线上出现额外的峰,通常位于75左右。在qRT-PCR反应结束后,可以通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。可以通过适当减低引物浓度以避免。

在qRT-PCR中有基因组污染:重新制备cDNA模板即可

4、实验重复性很差

移液枪不准,加样不准确:这种情况下,可以更换最佳使用量程的性能更好的移液枪,并定期对移液枪进行校准。

定量PCR仪在不同位置温度不一样:为获取准确的实验结果,定量PCR仪应定期进行校准。

qRT-PCR预混液未混合均匀:可以轻轻颠倒装有qRT-PCR预混液的离心管来促进混合。注意应避免剧烈摇动或振荡,以免引起气泡的形成。

以上提供的是qRT-PCR相对定量分析的详细步骤以及常见问题和解决方案,希望能对小伙伴们有所帮助!关注汉恒生物,如果您对于qRT-PCR实验还有任何疑问,都可以跟我联系!

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