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探针法荧光PCR(Taqman 技术)介绍

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探针法荧光PCR(Taqman 技术)介绍

探针

PCR扩增时,加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为寡核苷酸,两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团或受体基团。

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原理

受体基团及荧光共振能量转移

如果一个荧光基团的发射光谱与另一个基团的吸收光谱有一定的重叠,当二者的距离接近到一定程度,供体被激发光激发但是却不发出该物质的发射光,而是将能量转移至受体。如果受体荧光量子产率为零,则发生能量转移荧光熄灭;如果受体也是一种荧光发射体,则呈现出受体的荧光,并造成次级荧光光谱的红移。

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探针的种类

Ø经典的Taq-Man探针

Ø双杂交探针(dual hybridization probe)

Ø分子信标探针(molecular beacon,MB)

Ø蝎形探针(Scorpions Probes)

Taq-Man探针

线性的探针,连在同一条寡核苷酸上,探针序列长度较短。

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近年来对Taq-Man探针进行改良发展出TaqMan-MGB探针, 在Taq-Man探针的3端加入一个能插入DNA小沟的二氢环化吲哚卟啉-三肽(DPI3),可以使大大提高探针的TM值,增加杂交反应的特异性。

双杂交探针(dual hybridization probe)

在两条寡核苷酸杂交探针上分别标记荧光供体基团和荧光受体基团。这两条探针都可以与扩增产物杂交,杂交位置不同但很接近,反应时两条探针一头一尾杂交于扩增产物上,杂交后两个基团距离在10nm以内(一般1-5碱基),此时产生荧光共振能量转移现象,激发光下供体基团不发光,受体基团发光,检测受体基团的发光情况既可以确认扩增产物的情况。

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分子信标探针

分子信标探针在与靶序列杂交前呈现一个茎环结构,通过杂交的方式改变探针二级结构。

分子信标探针采用的是在反应中增加荧光基团和淬灭基团距离的方法,和Taq-Man法不同,分子信标探针不是采用酶切的方式使荧光基团和淬灭基团分离,而是通过杂交的方式改变探针二级结构,增加两个基团的距离从而使荧光基团发光。

分子信标探针在与靶序列杂交前呈现一个茎环结构,其中环部分为能与靶序列互补杂交的特异性序列,臂部分互补,荧光基团和淬灭基团分别在两臂的末端,当分子信标探针呈茎环状态时,荧光基团和淬灭基团距离极近,荧光基团被淬灭。

当PCR扩增反应产生靶序列产物,探针环部分与靶序列发生杂交,两臂距离因此拉开,两个基团间的距离不能形成荧光共振能量转移,荧光基团发光。

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蝎形探针

探针部分和分子信标相似,也是5端有一个荧光基团,3端有一个淬灭基团,并且呈现茎环结构,与分子信标所不同的是,蝎形探针带有一段特异引物,可与相应的靶核酸结合,在Taq DNA聚合酶的作用下聚合延伸,得到扩增产物,而所带探针部分正好可以与延伸端的特异产物中互补序列杂交结合,因此,如有扩增存在,在不断变性复性过程中,蝎形探针即可不断与扩增子杂交,茎环结构打开,荧光基团不再被淬灭而被发射出来,荧光强度与扩增产物的含量呈正比。

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